腺病毒載體新冠疫苗代表企業(yè)

康希諾生物股份公司

廣州恩寶生物醫(yī)藥科技有限公司

北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司

江蘇省疾病預(yù)防控制中心

腺病毒載體新冠疫苗制備工藝

簡單來說，就是把腺病毒中原有與復(fù)制相關(guān)的基因剔除，替換為新冠病毒刺突蛋白（S 蛋白）的基因。這樣做的目的是使重新組裝的病毒復(fù)制新冠病毒刺突蛋白，從而刺激我們的免疫系統(tǒng)啟動免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶。

圖1：腺病毒載體新冠疫苗技術(shù)（來源：康希諾生物 CanSinoBIO (cansinotech.com.cn)）

腺病毒載體新冠疫苗技術(shù)詳解：

? 作為載體的人5型腺病毒剔除了復(fù)制相關(guān)基因，在人體內(nèi)不會復(fù)制；

? 在被剔除基因的位置上，插入新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的基因；

? 腺病毒載體攜帶S基因進(jìn)入人體細(xì)胞；

? S基因進(jìn)入人體細(xì)胞后合成S蛋白，作為抗原激發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。（來源：康希諾生物 CanSinoBIO (cansinotech.com.cn)

圖2：腺病毒載體新冠疫苗制備工藝（來源：網(wǎng)絡(luò)）

腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案

1.細(xì)胞培養(yǎng)：用蘇州藍(lán)曉生物科技的Seplife? LX-MC-dex1微載體培養(yǎng)HEK293SF細(xì)胞。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)最具發(fā)展前途的一種動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，且容易放大。藍(lán)曉科技的微載體廣泛應(yīng)用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，藍(lán)曉科技自主研發(fā)的Seplife? LX-MC-dex1細(xì)胞培養(yǎng)微載體幾乎適合所有貼壁細(xì)胞（如Vero、CHO、293T及MDCK等），細(xì)胞可貼附微球 2D 表面生長，1g的Seplife? LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細(xì)胞貼附。

圖3：Seplife? LX-MC-dex1細(xì)胞培養(yǎng)微載體培養(yǎng)效果（來源：藍(lán)曉科技）

2.固液分離：細(xì)胞培養(yǎng)后，先經(jīng)過離心的方式固液分離去除培養(yǎng)基中水及培養(yǎng)基組分中的物質(zhì)；

3.細(xì)胞洗滌：固液分離后收集細(xì)胞，可以用生理鹽水重懸細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)行洗滌（工業(yè)上此工序可省略），保持細(xì)胞破碎時破碎的是純凈的細(xì)胞；

4.細(xì)胞重懸：細(xì)胞洗滌后，重懸細(xì)胞，重懸細(xì)胞要注意重懸緩沖液的種類及和重懸后的細(xì)胞濃度，濃度影響后面破碎效率，緩沖液影響后續(xù)純化過程，盡量保持和下游工藝的合理銜接，避免置換緩沖液；

5.細(xì)胞破碎：重懸后可以用去污劑Tween20.Tween80.Triton X-100等破碎細(xì)胞，或者通過凍融的方式破碎細(xì)胞，破碎后可以測定病毒滴度，保證病毒全部釋放出來；

6.破碎液固液分離：破碎后再次離心固液分離，收集上清；

7.破碎上清液澄清：上清液在用微濾（GF）的方式進(jìn)行澄清處理（要特別注意澄清度，澄清度是影響后續(xù)層析填料及超濾（UF)膜組件使用壽命的關(guān)鍵因素之一），澄清度可以通過測濁度的方式檢測；

8.核酸酶處理：澄清后加入核酸酶處理，降解核酸降低粘度，考慮核酸酶活加入的量及酶處理時間，核酸酶處理時要緩慢攪拌，保證處理的均勻性；

9.置換緩沖液：用超濾膜組件進(jìn)行緩沖液置換，保證緩沖體系適合下一步層析過程，同時置換時也可以適當(dāng)濃縮，注意超濾時的跨膜壓及超濾時剪切力對病毒完整性的影響；若8工序后的樣品不影響粗純的層析過程（需要從細(xì)胞重懸工序開始合理選擇緩沖液，及破碎方式的選擇考慮）此工序可省去；

10.粗純：腺病毒可用陰離子交換層析吸附——洗脫模式(大多數(shù)病毒在中性pH環(huán)境中都帶負(fù)電荷）進(jìn)行粗純及濃縮，推薦使用蘇州藍(lán)曉生物科技高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)（Seplife large scale Q )，離子交換層析的過程，病毒被吸附在填料上，吸附的過程也會把病毒濃縮在填料上，蘇州藍(lán)曉生物科技的Seplife large scale Q 介質(zhì)吸附腺病毒的載量在3-6mg/ml(與工藝緩沖液，層析時保留時間，不同腺病毒有關(guān)），用陰離子交換層析吸附——洗脫模式粗純腺病毒載體新冠疫苗時，可以運用DOE，系統(tǒng)的表征各個層析工藝參數(shù)，達(dá)到最優(yōu)的純化結(jié)果（回收率和純度），減輕后續(xù)精純工序的壓力；

11.精純：粗純得到樣本，在通過凝膠過濾層析進(jìn)一步精細(xì)純化，腺病毒分子尺寸比較大（如Ad5分子尺寸約60-70nm，不同型的腺病毒有差異），蘇州藍(lán)曉生物科技的Seplife 4FF瓊脂糖微球凝膠過濾介質(zhì)的平均孔徑在50nm，用此填料腺病毒新冠疫苗被排阻在填料孔道外部，通過填料顆粒間隙流穿，而其它雜質(zhì)如HCP,HCD,核酸酶等分子尺寸比較小，進(jìn)入道填料通過擴散的作用進(jìn)入道填料孔道內(nèi)部，然后在通過擴散的作用散出填料孔道，這個過程中同樣的緩沖液作用，擴散過程需要更多的熱力學(xué)動力（即需要更多的緩沖液作用），而伴隨緩沖液流動的病毒粒子需要的動力小伴隨緩沖液一起流出，通過整個凝膠過濾柱床反復(fù)的分離，病毒顆粒在填料柱床的外水體積（即填料顆粒之間的間隙空間，約占柱床體積的30%），病毒分子最先流出柱床，其它物質(zhì)后面流出柱床，即可實現(xiàn)腺病毒載體新冠疫苗的精細(xì)純化。同時精純過程也可以用蘇州藍(lán)曉生物科技的復(fù)合模式層析介質(zhì)Seplife? Suncore 700進(jìn)行純化，病毒溶液進(jìn)入柱床中，分子尺寸大的病毒顆粒被排阻在填料惰性層外面流穿而過，分子尺寸小的HCP,HCD，內(nèi)毒素等物質(zhì)進(jìn)入到孔內(nèi)和填料以靜電力，疏水作用力等結(jié)合，可以實現(xiàn)高上樣量尺寸排阻層析過程，配合粗純工藝即可完成腺病毒載體的純化。

12.除菌及制劑：略

圖4：腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案（自制）

★★★★★特別注意：每一個單元操作之后進(jìn)行下一個單元操作時，都必須考慮緩沖液體系的適用性及病毒粒子濃度，是否需要通過超濾濃縮伴隨置換緩沖液的方式調(diào)整病毒粒子的濃度和緩沖液體系。

腺病毒載體新冠疫苗下游純化工藝方案一

澄清的病毒溶液經(jīng)高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)Seplife large scale Q 粗純及濃縮，去除大部分的雜質(zhì)，減少體積，然后在經(jīng)多模式復(fù)合型層析介質(zhì)Seplife? Suncore 700精細(xì)純化，即可達(dá)到疫苗要求的純度進(jìn)行后續(xù)的制劑化。

圖5：腺病毒載體新冠疫苗下游純化工藝方案一（自制）

注意事項：

離子交換層析過程需要全面考慮，如上樣量，保留時間，緩沖液種類及濃度及pH，洗脫液種類及pH，濃度，洗脫模式（如高pH低濃度鹽結(jié)合高鹽洗脫，高pH低鹽結(jié)合低pH低鹽洗脫，低pH中等濃度鹽結(jié)合低pH高鹽洗脫等），洗脫過程pH梯度或者鹽梯度或者pH和鹽同時梯度等方式的實施以實現(xiàn)最優(yōu)的分辨率和回收率。離子交換層析是優(yōu)化空間很大的一種層析過程，借助DOE，系統(tǒng)的表征各個層析參數(shù)必要且重要。

同時Seplife large scale Q(平均粒徑90um）也可以用分辨率更高的Seplife large scale Q HP(平均粒徑37um)代替，但高分辨的填料粒徑小，同樣流速下有更高的背壓，所以還要根據(jù)實際情況合理選擇。

腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案二

澄清的病毒溶液經(jīng)高剛性離子交換層析（Seplife large scale Q)粗純及濃縮后，還有微量的雜質(zhì)需要去除，即可以選擇多模式復(fù)合型層析填料（Seplife? Suncore 700）進(jìn)一步純化也可選擇凝膠過濾層析(Seplife 4FF)進(jìn)行精細(xì)純化。

圖6：腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案二（自制）

注意事項：

不同廠家的腺病毒載體疫苗選用的腺病毒類型不同，他們的分子尺寸也不同，若腺病毒分子尺寸小于50nm，可將精純工序的凝膠過濾填料Seplife 4FF更換成孔徑小一些的Seplife 6FF凝膠過濾層析填料。

腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案三

澄清的病毒溶液經(jīng)超濾（UF)高倍濃縮伴隨洗濾之后，用凝膠過濾層析純化是病毒類物質(zhì)純化的通用技術(shù)也是病毒類物質(zhì)純化用的最多的技術(shù)，同樣腺病毒載體新冠疫苗也可以用此技術(shù)進(jìn)行純化。

圖7：腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案三（自制）

注意事項：

超濾(UF)膜組件的選擇及跨膜壓的確定，對濃縮效果回收率影響很大。

凝膠過濾層析時利用連續(xù)上樣的方式可以提高凝膠過濾層析的效率。

腺病毒載體類生物制品制備相關(guān)產(chǎn)品

蘇州藍(lán)曉生物生物科技有限公司

細(xì)胞培養(yǎng)微載體

Seplife? LX-MC-dex1

高剛性瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)

Seplife large scale Q

高剛性高分辨率瓊脂糖微球陰離子交換介質(zhì)

Seplife large scale Q HP

多模式復(fù)合型層析填料

Seplife? Suncore 700

凝膠過濾層析填料

Seplife 4FF

Seplife 6FF

擴展—基因治療載體—腺病毒載體純化

在基因治療領(lǐng)域，核酸轉(zhuǎn)運中腺病毒載體也被廣泛應(yīng)用，腺病毒載體轉(zhuǎn)運核酸不管是運用在疫苗上還是基因治療上，其區(qū)別只是運轉(zhuǎn)的核酸不同，制備過程一致，所以上面介紹的腺病毒載體新冠疫苗下游工藝解決方案，同樣適用于基因治療病毒載體及其它病毒載體類生物制品——腺病毒載體的分離純化。

一家之言，難免疏誤！請您指正！

蘇州藍(lán)曉生物科技有限公司，生物制藥下游工藝解決方案專業(yè)供應(yīng)商！

—— 代表產(chǎn)品 ——

?高流速瓊脂糖介質(zhì)

離子交換填料：DEAE/Q/CM/SP seplife? FF等

凝膠過濾填料：seplife? 4FF/6FF等

疏水填料：Phenyl/Butyl seplife? FF等

親和填料：Ni/Blue/rProtein A seplife? FF等

?超高載量瓊脂糖介質(zhì)

DEAE/Q/CM/SP seplife? XL等

?葡聚糖介質(zhì)

凝膠過濾填料：seplife?  G25/G50/G75等

離子交換填料：DEAE/Q seplife? A25/A50等

CM/SP seplife? C25/C50等

?高剛性瓊脂糖介質(zhì)

seplife? large scale Q/SP/DEAE等

?聚合物介質(zhì)

seplife?RP/IEX/HIC等

?多模式介質(zhì)

seplife? large scale MMC/MMC(Ⅱ）等

seplife? large Suncore 700等

seplife? LH-20等

?細(xì)胞培養(yǎng)微載體

seplife? LX-MC-dex 1等

?核酸固相合成載體

交聯(lián)苯乙烯（羥基、氨基）等

?多肽合成載體

Merrifield樹脂/Wang 樹脂等

?酶固定化載體

seplife? LX-505P/LX-1000EP/EP200等

現(xiàn)高流速瓊脂糖介質(zhì)，超高載量瓊脂糖介質(zhì)，高剛性瓊脂糖介質(zhì)，葡聚糖介質(zhì)，單分散聚合物介質(zhì)，多模式介質(zhì)，細(xì)胞培養(yǎng)微載體，核酸固相合成載體，多肽固相合成載體，酶固定化載體等年產(chǎn)均超過50000升。