概論

現代生物技術一般認為包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術，而這些技術的發展幾乎都與細胞培養有密切關系，特別是在醫藥領域的發展，細胞培養在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵的核心作用。下面我們盤點一下細胞復蘇、傳代到凍存的步驟和經驗，希望對廣大科研工作者有所幫助。

細胞復蘇

細胞復蘇和凍存講究“慢凍快溶”，復蘇時一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

復蘇準備

?打開水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺上放好離心管（一般15ml的），細胞培養瓶，移液管，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風5至10分鐘除去臭氧。

?37℃預熱好要復蘇細胞的培養液，也可以不用預熱培養液，根據細胞情況選擇。

?向離心管中加約5至10ml培養液，從液氮罐或-80℃中取出凍存細胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細胞轉移至含培養液的離心管中，800-1000rpm下離心5min，棄上清，加適量完全培養液輕輕吹打重懸細胞后轉移至細胞培養瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻，標好細胞名稱、代數、復蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養箱中。一般貼壁細胞過夜即可貼壁，換液和傳代時間根據不同細胞生長情況而定。

細胞復蘇注意事項

?復蘇時動作要快，盡量減少胞內形成冰晶，影響復蘇后細胞活率。

? 融化時盡量不要碰到管口，以免容易造成污染。

?若一次性需要復蘇細胞很多，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細胞融化時間延長。

?若需要同時復蘇好幾種細胞，提前在離心管和培養瓶上做好標記，或記住自己擺放的位置，不要弄混亂。

細胞傳代培養

懸浮細胞傳代

待培養液中酚紅指示劑變黃，在已紫外滅菌后的超凈臺上吸出或倒出細胞懸液至離心管中（根據細胞液的量選擇15ml或50ml離心管），800-1000rpm下離心5min，棄去營養匱乏的舊培養液，加預熱好的完全培養液適量，輕輕吹打重懸細胞后，吸取適量細胞懸液轉移至細胞培養瓶中，或直接取適量細胞懸液至新培養瓶中，再補加一定量新鮮完全培養液進行傳代，有些脆弱的細胞用自然沉降法沉降細胞，吸去上面舊培養液加入新的完全培養液后吹散進行傳代。傳代接種的細胞密度根據不同細胞生長情況而定，一般間隔1-2天即可傳代一次。

細胞微載體培養

微載體培養是目前公認的最有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術，其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，放大容易。將對細胞無害的微載體顆粒加入培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴增三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，因此細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。細胞主要通過靜電引力和范德華力與微載體黏附，這取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

藍曉科技的微載體廣泛應用在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規模生產中，藍曉科技自主研發的Seplife LX-MC-dex1細胞培養微載體在Vero細胞、CHO細胞、293T細胞及MDCK細胞等已廣泛用于生物制品的大規模生產中，細胞可貼附微球 2D 表面生長，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細胞貼附。

Seplife LX-MC-dex1技術參數

細胞生長曲線

圖1：藍曉科技細胞培養微載體和進口微載體用于Vero細胞培養生長曲線

細胞生長情況觀察

圖2：藍曉科技細胞培養微載體用于Vero細胞培養細胞生長情況觀察

Seplife LX-MC-dex1微載體的應用領域非常廣泛，基于微載體生產的疫苗除了新冠以外，還包括脊髓灰質炎、風疹、狂犬病、流感、日本腦炎（乙型腦炎）、呼吸道合胞病毒（RSV）和口蹄疫（FMD）疫苗等。與其他細胞培養工藝相比，微載體培養工藝可以提高產量，降低成本，并減少污染。

貼壁細胞傳代

待培養瓶底中細胞覆蓋率達70%-80%時，在經紫外滅菌后的超凈臺上，棄去舊細胞培養液，用無菌1*PBS洗滌瓶底細胞1-2次，用1ml（T25培養瓶）或2ml（T75培養瓶）trypsin溶液37℃下作用細胞，待顯微鏡下細胞回縮變圓，少部分細胞出現流沙狀時，快速吸去trypsin溶液，加預熱好的新鮮完全培養液終止消化，輕輕吹打使細胞脫落且分散均勻，直接吸取適量細胞懸液轉移至新培養瓶中，或800-1000rpm下離心去上清，加適量新鮮完全培養液吹打重懸細胞，然后轉移適量細胞懸液至新培養瓶中，再加入一定量完全培養液，搖勻瓶底細胞液后進行培養。

細胞傳代培養注意事項

?吹打時每次不要排完移液管中液體，同時控制吹打節奏，這樣不容易吹出泡沫，泡沫對細胞有損傷作用，而且很難再顯微鏡下觀察清楚有沒有完全吧細胞吹打下來。

?不要等到貼壁細胞完全鋪滿瓶底，要留有一定空隙時細胞狀態才良好。

?消化時最好不要等到細胞成片飄起，否則細胞狀態受影響且第二天培養中死細胞較多。

細胞凍存

凍存的細胞要處在指數生長期。懸浮細胞和貼壁細胞經離心后用凍存液重懸，計數，凍存的細胞密度一般3*106-1*107 cells/ml，最好不少于1*106 cells/ml，否則復蘇后難以養起來，將重懸計數后的細胞懸液以1-1.5ml快速分裝至各凍存管中，迅速擰緊蓋子，放入梯度凍存盒然后置于-80℃過夜，也可以先4℃放置30分鐘，再-20℃放置1-2小時，最后-80℃過夜（16-18小時），若梯度凍存盒不夠或無凍存盒，可以將凍存管置于泡沫盒中，用棉花包起來，棉花厚度約1cm，置于-80℃過夜，第二天取出-80℃細胞存放至液氮罐中，并在記錄好存放位置信息。

凍存準備

?配制好凍存液。一般凍存液為培養液，血清，DMSO按照7:2:1的比例配制，也可以血清和DMSO按照9:1配制，不管哪種凍存液配制，血清多多益善，但DMSO都不可以多，以免對細胞造成損傷。

?準備好凍存管，標上細胞名稱，代次，凍存批號，凍存日期。

?準備好細胞程序降溫盒或凍存用的材料，程序降溫盒放置室溫后使用。

細胞凍存注意事項

?程序降溫盒有無需有毒異丙醇填充的，有利于實驗人員身體健康。

?DMSO有毒且皮膚會吸收，做好防護措施。DMSO本身不長菌，不需要做滅菌處理。

?由-80℃轉至液氮時迅速，避免溫度上升影響細胞活性。

?每個凍存管不要加入體積太多，以免凍存時凝固體積膨脹，撐開凍存管，且在下次復蘇時，融化較慢，導致復蘇后細胞存活率不高。