Seplife LX-MC-Dex1微載體

藍(lán)曉科技自主研發(fā)的Seplife LX-MC-Dex1細(xì)胞培養(yǎng)微載體在Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HEK293T細(xì)胞及MDCK細(xì)胞等已廣泛用于生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中，細(xì)胞可貼附微球 2D 表面生長(zhǎng)，1g的Seplife LX-MC-dex1微載體提供 4400 cm2的表面積給細(xì)胞貼附。在疫苗、單抗、基因治療病毒載體等生物制品的大規(guī)模生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。

在Vero細(xì)胞商業(yè)化病毒疫苗生產(chǎn)規(guī)模培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)分析藍(lán)曉科技的Seplife LX-MC-Dex1微載體在細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度及消化后重新貼壁情況，及多個(gè)商業(yè)化病毒生產(chǎn)規(guī)模的驗(yàn)證，藍(lán)曉科技的Seplife LX-MC-Dex1微載體在病毒類(lèi)生物制品制備中表現(xiàn)出卓越的品質(zhì)。

細(xì)胞生長(zhǎng)密度

Vero細(xì)胞在四種培養(yǎng)基內(nèi)，24h、48h、72h、96h后細(xì)胞生長(zhǎng)密度如表1所示。

表1：細(xì)胞生長(zhǎng)密度

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Vero細(xì)胞在兩家不同批次微載體的培養(yǎng)基中，24h至96h細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖2所示。

圖2：藍(lán)曉科技細(xì)胞培養(yǎng)微載體和進(jìn)口微載體用于Vero細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線

細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)觀察

Vero細(xì)胞在不同批次微載體的培養(yǎng)基中，第24h、48h、72h、96h細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁狀態(tài)如圖3、圖4、圖5、圖6所示。

圖3 藍(lán)曉微載體培養(yǎng)24h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖4 藍(lán)曉微載體培養(yǎng)48h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖5 藍(lán)曉微載體培養(yǎng)72h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況

圖6 藍(lán)曉微載體培養(yǎng)96h后細(xì)胞生長(zhǎng)情況

細(xì)胞消化后觀察

胰酶消化藍(lán)曉微載體20min后，細(xì)胞的脫落狀態(tài)，如圖7所示。

圖7 藍(lán)曉微載體消化后細(xì)胞分散情況

細(xì)胞消化后貼壁觀察

胰酶消化藍(lán)曉微載體后培養(yǎng)12h，觀察細(xì)胞的貼壁情況，如圖8所示。

圖8 藍(lán)曉微載體消化后培養(yǎng)12h細(xì)胞貼壁情況

由細(xì)胞的貼壁、生長(zhǎng)狀態(tài)、細(xì)胞密度及消化后重新貼壁情況觀察可以得出，Vero細(xì)胞在藍(lán)曉科技微載體Seplife LX-MC-Dex1上能夠生長(zhǎng)，胰酶消化后細(xì)胞分散情況符合標(biāo)準(zhǔn)，是病毒類(lèi)生物制品制備之利器。

Seplife LX-MC-Dex1微載體使用方法

1.微載體預(yù)處理

首先，干燥的微載體在無(wú) Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸緩沖液（PBS pH=7.4，每克微載體加50-100ml）中在室溫下浸泡膨脹至少 3 小時(shí)。然后，棄去上清液，用新配制的無(wú) Ca2+ 、Mg2+ 的PBS（pH=7.4，每克微載體加30-50ml）洗滌微載體數(shù)分鐘。接著，棄去 PBS，換上新的無(wú) Ca2+ 、Mg2+ 的 PBS（pH=7.4，每克微載體加 30-50ml）。之后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15min，15psi）。微載體Seplife LX-MC-dex1 非常穩(wěn)定，可以反復(fù)（至少5次）長(zhǎng)時(shí)間 （130°C，12h，27psi）進(jìn)行高壓滅菌而不影響其性能。滅菌結(jié)束后使用前，加入培養(yǎng)基潤(rùn)洗置換（20-50ml/g），之后加入 10%血清或無(wú)血清培養(yǎng)基放置過(guò)夜。

2.微載體培養(yǎng) 

準(zhǔn)備好消化好的細(xì)胞，連同之前準(zhǔn)備好的微載體一起加入方瓶或反應(yīng)器中（微載體加量 1-5g/L），在一定條件下開(kāi)始培養(yǎng)，4 小時(shí)后觀察細(xì)胞貼附情況。如果細(xì)胞貼附良好，繼續(xù)跟蹤培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

3 微載體培養(yǎng)操作要點(diǎn) 

（1）培養(yǎng)初期：

保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的 pH 與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期， 而非穩(wěn)定期）至終體積 1/3 的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。常使用 2-3g/L 的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)， 維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大速度 75r/min。 

（2）貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質(zhì) 混合。 

（3）培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增 殖，微球變得越來(lái)越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過(guò) 3d 左右，培養(yǎng)液開(kāi)始呈酸性，需換液。具體方 法：停止攪拌，讓微珠沉淀 5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重 新開(kāi)始攪拌。

（4）收獲細(xì)胞：首先，排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗 1 遍；然后，加入相應(yīng)的酶，快速 攪拌（75-125r/min）20-30min；最后，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。 

（5）微載體培養(yǎng)的放大：可以通過(guò)增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或 原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至 4000L 以上。

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