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全面解析His標(biāo)簽蛋白純化及金屬螯合層析

2021-12-19 12:57:21

His-Tag融合蛋白簡(jiǎn)介

His-Tag融合蛋白是目前最常見(jiàn)的蛋白表達(dá)方式,而且很成熟,它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)方便且不影響蛋白的活性,無(wú)論是可溶性表達(dá)或者包涵體都可以用固定金屬離子親和層析(IMAC)純化。IMAC是Porathetal.1975年用固定IDA作為配基的介質(zhì)螯合過(guò)渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子,可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白。1987年Hochulietal.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA介質(zhì)作用力更強(qiáng)于普通的肽,1988年他第一次用這樣的方法純化了帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的多肽,無(wú)論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果,此后表達(dá)帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍,相對(duì)而言,不帶標(biāo)簽的蛋白純化就非常困難,所以表達(dá)帶六個(gè)組氨酸標(biāo)簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有力手段。

金屬螯合層析的分離原理

組氨酸(His)的殘基上帶有一個(gè)咪唑基團(tuán),可以和Ni2+,Co2+等過(guò)渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上,這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質(zhì)上,因此帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白在經(jīng)過(guò)裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時(shí)可以選擇性的結(jié)合在介質(zhì)上,而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或者僅能微弱結(jié)合。結(jié)合在介質(zhì)上的HIS標(biāo)簽蛋白可以通過(guò)提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性洗脫,從而得到較高純度的HIS標(biāo)簽蛋白。

同時(shí)半胱氨酸(Cys)的殘基上的巰基,色氨酸(Trp)的殘基上的吲哚基也可以Ni2+,Co2+等過(guò)渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬螯合介質(zhì)上。

經(jīng)典金屬螯合介質(zhì)

?Ni Seplife FF(IDA)——載量高,高流速,純化效率,但不適合含有8M尿素及EDTA,DTT的樣品純化。點(diǎn)擊下載:Ni螯合高流速瓊脂糖微球介質(zhì)IDA說(shuō)明書(shū)

?Ni Seplife 6FF(NTA)——載量高,耐受性,適合含有8M尿素及6M鹽酸胍的樣品的純化。點(diǎn)擊下載:Ni螯合高流速瓊脂糖微球NTA說(shuō)明書(shū)

?Ni Seplife FF(TED)——耐受性好,可以耐受100mM EDTA,非常適合真核外泌蛋白的純化。可直接使用NaOH在位清洗,無(wú)需脫鎳掛鎳,省時(shí)省力。含有8M尿素及6M鹽酸胍的樣品用此鎳填料影響結(jié)合,低豐度的樣品結(jié)合效率效率差。點(diǎn)擊下載:Ni螯合高流速瓊脂糖微球介質(zhì)TED說(shuō)明書(shū)

?Ni Seplife HP(IDA)——小粒徑基質(zhì)使其有更高的分辨率。

?IMAC Seplife FF(IDA)——可以自己鰲合不同的金屬離子,適合純化外露His,Cys,Try  殘基的蛋白。

His-Tag純化時(shí)金屬螯合介質(zhì)的選擇

?科研微量制備——Ni Seplife HP(IDA),此填料分辨率高,科研微量制備可用此填料純化,純度更高。

?樣品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,樣品中含有EDTA及DTT時(shí)無(wú)需換液直接過(guò)鎳柱純化。

?樣品中含有8M尿素(6M鹽酸胍)——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差,TED結(jié)合力弱,在含有高濃度尿素時(shí)結(jié)合效率差,所以含有變性劑的樣品首選IMAC的鎳柱。

?含有Cys/Try殘基蛋白——含有Cys/Try  殘基的蛋白和鎳填料的結(jié)合力弱,此時(shí)可以選擇IMAC Seplife FF(IAD)的填料螯合Cu離子進(jìn)行親和純化(如烏司他丁可用此填料純化)

His-Tag融合蛋白純化常見(jiàn)問(wèn)題

1.His標(biāo)簽蛋白不和介質(zhì)結(jié)合

a可能原因:超聲功率不合適(太大,蛋白碳化,太小,蛋白沒(méi)完全釋放)

解決方法:改變超聲功率或者其它方法破碎細(xì)胞。

b.樣品或緩沖液不合適

解決方法:確保緩沖液中螯合劑,還原劑,咪唑濃度不是很高。

c.His標(biāo)簽暴露不完全

解決方法:在緩沖液中加變性劑(4-8M尿素,4-6M鹽酸胍),然后用IMAC介質(zhì)純化。

d.His標(biāo)簽丟失

解決方法:必要時(shí)增加His的個(gè)數(shù)并確保正確表達(dá),同時(shí)降低上樣速度,確保足夠的孵育時(shí)間。


2.His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在介質(zhì)上洗脫困難

a.可能原因:洗脫條件太溫和

解決方法:增加洗脫咪唑濃度或降低pH。

b.可能原因:蛋白沉積在介質(zhì)上

解決方法:減少上樣量,優(yōu)化層析條件。

c.可能原因:非特異性結(jié)合

解決方法:緩沖液加2% Triton X-100和NaCl。

3.洗脫峰雜質(zhì)多

可能原因:非特異性結(jié)合,清洗不徹底,降解等。

解決方法:純化過(guò)程加蛋白抑制劑防止降解,上樣完后要徹底清洗,加一定的NaCl和咪唑減少非特異性結(jié)合。

4.使用幾次后,介質(zhì)結(jié)合效率降低,柱效降低。

可能原因:介質(zhì)上沉積大量雜質(zhì)等

解決方法:徹底清洗,IDA/IMAC脫鎳再生處理


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