概論

在生物制藥、結(jié)構(gòu)研究、體外生物化學(xué)分析等很多應(yīng)用中都需要進(jìn)行蛋白質(zhì)等生物分子純化。蛋白質(zhì)可以從組織中獲取，亦或更經(jīng)常的是從模式生物中過量表達(dá)獲得，如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)等。蛋白質(zhì)純化主要是根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異來從原料種進(jìn)行分離純化，其目的就是獲得最多且高純度的功能蛋白質(zhì)。一個(gè)好的蛋白質(zhì)的純化過程必須要將其純化工藝步驟優(yōu)化至最少。

建立蛋白質(zhì)純化工藝時(shí)，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質(zhì)應(yīng)能滿足其后續(xù)應(yīng)用要求。蛋白質(zhì)的含量及純度都必須滿足應(yīng)用要求。而且，因?yàn)楹罄m(xù)應(yīng)用需要的是保持良好折疊結(jié)構(gòu)的活性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)活性的相關(guān)信息也需要考慮。在純化及后續(xù)的保存過程中，很多處理方法都會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的性質(zhì)產(chǎn)生影響，如蛋白質(zhì)的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細(xì)計(jì)劃，在最短時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)純化，并在最穩(wěn)定的條件下進(jìn)行保存才算是成功地完成了其整個(gè)純化過程。

緩沖液的建立

每一步純化過程中，蛋白質(zhì)的溶液環(huán)境對(duì)其穩(wěn)定性和活性的保持都非常關(guān)鍵。蛋白質(zhì)應(yīng)該保存在一個(gè)良好的緩沖液環(huán)境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對(duì)蛋白質(zhì)折疊狀態(tài)、溶解性和活性造成不可逆的影響。

緩沖液是一種含有共軛酸/堿對(duì)的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據(jù)其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結(jié)構(gòu)，50%為堿式結(jié)構(gòu)時(shí)的pH值 （圖1）。

圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當(dāng)pH=8.06，50%的Tris是質(zhì)子化（酸式結(jié)構(gòu)），50%是去質(zhì)子化（堿式結(jié)構(gòu)）。

關(guān)于緩沖液的一個(gè)常規(guī)原則是，其pH值應(yīng)保證在pKa值左右1個(gè)pH值單位范圍內(nèi)，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時(shí)有足夠的以酸式結(jié)構(gòu)和堿式結(jié)構(gòu)存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時(shí)可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改變。

一種好的緩沖液應(yīng)具備以下特征：

水溶性

化學(xué)穩(wěn)定性

在所需pH范圍內(nèi)良好的緩沖能力

與分析和實(shí)驗(yàn)應(yīng)用條件具有良好的兼容性

與其他溶質(zhì)具有良好的兼容性

很多物質(zhì)都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應(yīng)用范圍及各自可能對(duì)蛋白質(zhì)純化過程產(chǎn)生影響的優(yōu)缺點(diǎn)。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為20mM。

表一：蛋白質(zhì)純化中最常用的生物緩沖液。緩沖液在一定pH值范圍內(nèi)可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會(huì)對(duì)某些層析過程或者分析實(shí)驗(yàn)造成影響。

溶液添加劑

除了一個(gè)合適的緩沖液體系，蛋白質(zhì)純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對(duì)蛋白質(zhì)純度、穩(wěn)定性和活性方面均具有一定作用的成分。

溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會(huì)添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r(shí)幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。

表二：蛋白質(zhì)純化中用于增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的常用添加劑。

添加劑只在必要時(shí)才使用?？赡苄枰啻螄L試才能確定某些添加劑是否對(duì)一些特定蛋白質(zhì)的純化工藝有效。

其它因素

蛋白質(zhì)純化工藝中的其他因素也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。對(duì)蛋白質(zhì)的處理步驟越少越好，在最短時(shí)間內(nèi)采用最少步驟的純化工藝才能保證得到最高產(chǎn)率的活性蛋白質(zhì)。而且，在整個(gè)純化過程中，蛋白質(zhì)最好都保持在低溫狀態(tài)。一般純化過程都在4°C進(jìn)行,因?yàn)檫@個(gè)溫度既可以降低酶解速度（在含有蛋白酶的情況下），又可以保證蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。

表達(dá)體系對(duì)蛋白純化的影響

開始純化蛋白前應(yīng)先制備初始樣品。真正進(jìn)行蛋白純化的操作之前，首要考慮是目的蛋白的來源。樣品來源可為原始樣品，例如肝臟，肌肉或腦組織。當(dāng)前，更為常見的是從重組來源的樣品純化蛋白質(zhì)。一些重要決定需要提前考慮以便優(yōu)化后續(xù)的純化。研究者需要考慮蛋白質(zhì)的最終用途（例如治療性生物藥，酶測(cè)定，結(jié)構(gòu)研究，抗體生成），因?yàn)檫@將決定最終蛋白質(zhì)制備所需的量和純度。盡管蛋白質(zhì)表達(dá)的詳細(xì)討論超出本文范圍，但是在這一點(diǎn)上仍有幾個(gè)值得考慮的基本點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冎苯佑绊懞罄m(xù)的蛋白純化。

如果選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終目的可溶性表達(dá)或包涵體形式，由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構(gòu)成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的最終產(chǎn)量相平衡 [1] 。已經(jīng)有許多工作優(yōu)化了從包涵體中產(chǎn)生功能蛋白的產(chǎn)量 [2] 。

另一個(gè)考慮是是否靶向胞內(nèi)或胞外（分泌的）表達(dá)。胞內(nèi)表達(dá)需要將蛋白質(zhì)從大量宿主細(xì)胞蛋白中純化而來。相比之下，特別是當(dāng)宿主細(xì)胞在無血清條件下生長時(shí) [3] ，目標(biāo)蛋白的有效分泌要求蛋白必須從少量分泌的宿主蛋白中純化而來。

初始樣品制備

無論目標(biāo)蛋白的來源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時(shí)也需要考慮表達(dá)和純化策略。

目標(biāo)蛋白的胞外分泌可使用簡(jiǎn)單快速親和純化方案 [3] ；所需的唯一樣品制備可能需要傾倒貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或者低速離心以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，制備過程的第一步親和層析時(shí)可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調(diào)節(jié)pH，但這些步驟簡(jiǎn)單易行。然而，如果第一步純化樣品步驟進(jìn)行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽或者緩沖液置換。

如果靶蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，則細(xì)胞首先需要通過離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的最大穩(wěn)定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時(shí)的緩沖液置換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。

接下來，需要有效的細(xì)胞裂解方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規(guī)?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業(yè)裂解試劑）。通過向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率。基于洗滌劑的裂解非常溫和，且不導(dǎo)致細(xì)菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產(chǎn)生具有良好流動(dòng)特性的樣品，通常需要加入核酸酶孵育（高純度制劑可商購） [4] 。

哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞也可以通過超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要核酸酶處理降低樣品粘度 [4] 。

一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲/哺乳動(dòng)物）被裂解，通常需要離心或者微濾除去細(xì)胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，或者用0.22-0.45um的膜組件過濾，以避免層析柱堵塞） [4] 。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱層析純化。

參考資料

1. Burgess R. Refolding solubilized inclusion body proteins. Methods Enzymol. 2009;463:259-82 

2. Singh A, Upadhyay V, Upadhyay A, Singh S, Panda A. Protein recovery from inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process. Microb Cell Fact. 2015;14:41 

3. Scott M, Modha S, Rhodes A, Broadway N, Hardwicke P, Zhao H, et al. Efficient expression of secreted proteases via recombinant BacMam virus. Protein Expr Purif. 2007;52:104-16 

4. Grabski A. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 2009;463:285-303