Q:包涵體使用透析方式進行復性，蛋白濃度，復性液以及復性溫度如何研究？

A:我們都是稀釋復性的，工業上復性主要是稀釋法。

Q:也嘗試了稀釋復性，但是蛋白都以聚集沉淀除去了，你們的復性液一般是什么？

我采用的復性液：50 mM Tris-HCl，0.05%聚乙二醇(PEG)4000，5%甘油，0.1mM EDTA，100mMNaCl，0.01mM GSSG，pH8.0-8.5；將變性蛋白質稀釋15-60倍，使變性劑濃度降低至蛋白質可以進行重折疊的程度，即緩慢的將變性包涵體蛋白滴加至燒杯折疊緩沖液中，同時劇烈攪拌以快速混勻。稀釋過程在室溫下進行，混合完成后，將溶液靜置1-2小時以保證重折疊過程的完成，同時也使聚集物形成并出現絮凝物。

A: 我們沒有PEG和甘油，具體的參數還得自己摸索。

Q:處理方式是這樣嗎？

A:透析復性也不適合工業放大啊，只能實驗室搞搞。

Q:稀釋一般情況下終濃度保持在1-10ug/ml，對蛋白的回收率也是一種挑戰。無論是哪種方法，感覺這就是一門學問，成功的概率存在偶然性。

A:正確復性的如大海撈針。要不斷優化，比如稀釋法，緩沖液種類，離子強度，pH，添加劑，及添加量，滴加方式，攪拌速度，要系統得做試驗優化。做個DOE。

Q:包涵體或者分泌表達的層析方法大家可以分享交流一下。目前對這塊兒比較感興趣。

A:好多年前的經驗了：稀釋復性是最經典的效果最好；氧化還原對和分子伴侶在實驗室規模都還可以，不過不一定適合放大；透析損失是最大的；

柱上復性做研究可以，但工業上用的非常少，可能缺少工業成功案例，大家可以試試看，實驗室即使做成功了，也面臨著放大過程的很多問題。

Q:變性蛋白所處環境若發生突變，即短時間內變性劑濃度的大幅度變化，會迫使蛋白在短時間內形成更緊湊的結構，容易發生錯誤折疊和聚集，那么這和稀釋復性是存在矛盾的？

A:有交集不矛盾。稀釋復性，也可以嘗試將復性液分階段緩慢的加入到變性的蛋白溶液中，不劇烈，比如總稀釋50倍，可以先加5倍體積，停止一段時間在加5倍體積。

Q:參考蛋白質純化指南（美 R.R. 伯吉斯)通過稀釋復性之后0.22μm的濾膜過濾重折疊蛋白質，然后將其上柱（SP離子交換層析柱），竟然不與柱料結合，但是我的天然蛋白是結合的，也是無解。

A:做的是哪類的產品。還要注意一個問題，復性后蛋白的用途，生物醫藥和其它用途的蛋白對各種添加劑及各種物質限量的要求是完全不一樣的。

Q:還有更奇怪的，偶然的一次通過透析復性搞出了活性，但是再重復就做不出來了，無比的奇怪。

A:GSH／GSSG這兩個有沒有考慮添加，它們的配比是不是可以優化優化。

Q:這個我也嘗試了GSH／GSSG，沒有搞出活性，我的感覺是越做越迷茫。

A:包涵體復性是非常復雜的過程，要系統性的優化。

Q:嘗試了精氨酸，PEG，甘油等，無功而返。

A:濃度高也會影響。我這邊就是高濃度出現聚集。。。濃度，表面活性劑都還在考慮。還有個問題，復性效率的監測。。PAGE是個方式。但是效率慢。目前濃度略低。。。還在摸索中。