Q:蛋白N端帶his和C端帶his標簽對蛋白有什么不同嗎？

A:his-tag比較小，N或C對蛋白幾乎都沒有影響，若純化后要切除his-tag,好像加載C端比較好切除，切除后對蛋白沒有影響，若加N端，切除后對蛋白性質好像有影響。

Q:目的蛋白氨基酸序列插入pet-28a載體，發現我的目的氨基酸沒有終止子，所以N，C端都有載體的氨基酸序列（而且N,C端分別含有一個his標簽）。想問一下，這樣的重組蛋白對免疫活性有影響嗎？別人的目的蛋白都有終止子。C端沒有載體的氨基酸序列

A:his一般加c端較多，因為整個目的蛋白表達完整的，n端主要是可能有部分不完整蛋白，分泌蛋白信號肽在n端，一般重組蛋白還好吧。

引物設計和酶切為點選擇設計下，下游引物加個終止密碼子。

一般商業化載體上都會有終止密碼子，在c端標簽后面，仔細找找看。

Q:表達的是部分不完整的蛋白，人為添加的信號肽

A:是在N端加信號肽，C 端加標簽，如果標簽加在了疏水區就不好純化了

Q:載體的c端有終止子。只能在載體的終止子那終結。所以說又多表達了載體的十幾個氨基酸。想問一下，這10幾個氨基酸對于蛋白的活性有影響嗎，會不會遮蓋部分的表位。

A:可以用expasy數據庫分析一下目的蛋白的一級結構，有明顯的c端疏水結構，可以用疏水層析柱

Q:可以自己加終止子呀，有些非融合載體是自己加起始密碼子終止密碼子的

A:對，一般不會有影響，我之前用過pet載體，你怕影響，自己加到前面就好了

Q:大家有誰遇到過鎳柱結合不牢的，很低的咪唑就可以洗脫下來的

A:只要目的達到了，過程什么的不要太拘謹。換結合力強藍曉科技的Ni Seplife FF(IDA)或者銅離子的螯合填料可以提高結合力。

Q:結合的時候能全部結合目的蛋白嗎？不能

A:這種問題比較復雜，最直接的就是換IDA，其次是調整結合的緩沖體系（鹽濃度、pH），又或者是表達的時候存在結構，上樣前，加個1M尿素打開它，說不定結合會好一點。

Q:請教一個問題，強陽離子填料（高流速瓊脂糖FF型）用柱現在壓力比平常較高，這是用分別用0.5mol鹽酸，氫氧化鈉處理后的狀態，在使用的過程中有什么要注意的事項。

A:用8M尿素和30%異丙醇處理試試看.

Q:HEK293表達膜蛋白，想添加信號肽分泌到上清，有沒有什么信號肽可以推薦，提高蛋白表達量

A:在N端添加GP67信號肽

Q:藍曉科技都有那些純化his-tag蛋白的介質

A:Ni Seplife FF(IDA）——高載量

Ni Seplife FF(IDA）——8M尿素環境對蛋白結合無影響

Ni Seplife FF(TED）——穩定性好，可耐受100mM EDTA及10mM DTT

IMAC Seplife FF(IDA/NTA)——螯合金屬離子

Ni Seplife HP(IDA)——高分辨率

Q:金屬螯合層析介質有那些類型

A:如下圖所示