His標(biāo)簽蛋白用鎳柱純化有雜帶怎么辦

2021-12-23 13:05:18

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問:His標(biāo)簽蛋白鎳柱純化有雜帶怎么辦？

1.樣品本身的的屬性，His蛋白容易被體系中的蛋白酶降解時(shí)，此時(shí)就要在樣品中加入蛋白酶抑制劑。避免在純化過程中His蛋白被降解，呈現(xiàn)出純化后純度下降。

2.His蛋白和其它蛋白結(jié)合在一起，純化后也呈現(xiàn)出純度不夠，這時(shí)就需要考慮減少蛋白分子之間的作用力，比如加入2% Triton X-100或者加入10-50%的甘油等減少分子間的作用力。

3.理解鎳柱純化蛋白的原理，除帶有His標(biāo)簽的蛋白可以可以鎳柱結(jié)合，鎳柱也能和帶有半胱氨酸等氨基酸殘基的蛋白結(jié)合。理解僅靠一步鎳柱純化90%左右純度是正常的，若需要更高的純度，則需要繼續(xù)純化。比如鎳柱洗脫峰再多模式層析介質(zhì)（MMC/MA Large Scale )繼續(xù)純化.

4.層析體系需要優(yōu)化，緩沖體系的pH要在7.5-8.3之間，添加200-500mM氯化鈉減少非特異性吸附，上樣完后要徹底清洗，保證填料孔內(nèi)，顆粒間未結(jié)合的蛋白全部洗出后，在開始洗脫，保證上完樣后，清洗在10CV以上。洗脫過程需要摸索咪唑的強(qiáng)度梯度，用連續(xù)咪唑梯度來摸索洗脫濃度。

5.層析柱裝填的疏密不合適，層析柱的分配器分配的不均勻。這種情況在工業(yè)生產(chǎn)中影響也很大，會(huì)影響其純度等。

6.層析填料上端，和柱頭分配器間的體積太大，大中大型層析柱使用過程中，液距控制在0.5cm以內(nèi)，避免影響整個(gè)層析過程。