His-Tag融合蛋白簡介

His-Tag融合蛋白是目前最常見的蛋白表達方式，而且很成熟，它的優(yōu)點是表達方便且不影響蛋白的活性，無論是可溶性表達或者包涵體都可以用固定金屬離子親和層析（IMAC）純化。IMAC是Porathetal.1975年用固定IDA作為配基的介質(zhì)螯合過渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白。1987年Hochulietal.發(fā)現(xiàn)帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA介質(zhì)作用力更強于普通的肽，1988年他第 一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標簽的多肽，無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果，此后表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標簽的蛋白純化就非常困難，所以表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結(jié)構(gòu)和功能的有力手段。

金屬螯合層析的分離原理

組氨酸（His）的殘基上帶有一個咪唑基團，可以和Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質(zhì)上，因此帶有組氨酸標簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時可以選擇性的結(jié)合在介質(zhì)上，而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或者僅能微弱結(jié)合。結(jié)合在介質(zhì)上的HIS標簽蛋白可以通過提高緩沖液中的咪唑濃度進行競爭性洗脫，從而得到較高純度的HIS標簽蛋白。

同時半胱氨酸（Cys)的殘基上的巰基,色氨酸（Trp)的殘基上的吲哚基也可以Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬螯合介質(zhì)上。

經(jīng)典金屬螯合介質(zhì)

His-Tag純化時金屬螯合介質(zhì)的選擇

His-Tag融合蛋白純化常見問題

1.His標簽蛋白不和介質(zhì)結(jié)合

a可能原因：超聲功率不合適（太大，蛋白碳化，太小，蛋白沒完全釋放）

解決方法：改變超聲功率或者其它方法破碎細胞。

b.樣品或緩沖液不合適

解決方法：確保緩沖液中螯合劑，還原劑，咪唑濃度不是很高。

c.His標簽暴露不完全

解決方法：在緩沖液中加變性劑（4-8M尿素，4-6M鹽酸胍），然后用IMAC介質(zhì)純化。

d.His標簽丟失

解決方法：必要時增加His的個數(shù)并確保正確表達，同時降低上樣速度，確保足夠的孵育時間。

2.His標簽蛋白結(jié)合在介質(zhì)上洗脫困難

a.可能原因：洗脫條件太溫和

解決方法：增加洗脫咪唑濃度或降低pH。

b.可能原因：蛋白沉積在介質(zhì)上

解決方法：減少上樣量，優(yōu)化層析條件。

c.可能原因：非特異性結(jié)合

解決方法：緩沖液加2% Triton X-100和NaCl。

3.洗脫峰雜質(zhì)多

可能原因：非特異性結(jié)合，清洗不徹底，降解等。

解決方法：純化過程加蛋白抑制劑防止降解，上樣完后要徹底清洗，加一定的NaCl和咪唑減少非特異性結(jié)合。

4.使用幾次后，介質(zhì)結(jié)合效率降低，柱效降低。

可能原因：介質(zhì)上沉積大量雜質(zhì)等

解決方法：徹底清洗，IDA/IMAC脫鎳再生處理