His-Tag融合蛋白簡介
His-Tag融合蛋白是目前最常見的蛋白表達方式，而且很成熟，它的優(yōu)點是表達方便且不影響蛋白的活性，無論是可溶性表達或者包涵體都可以用固定金屬離子親和層析（IMAC）純化。IMAC是Porathetal.1975年用固定IDA作為配基的介質螯合過渡金屬銅、鎳、鈷或鋅離子，可以吸附純化表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白。1987年Hochulietal.發(fā)現帶有相連組氨酸的多肽和Ni2+-NTA介質作用力更強于普通的肽，1988年他第 一次用這樣的方法純化了帶六個組氨酸標簽的多肽，無論是在天然還是變性條件下一次親和純化都得到很好效果，此后表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC變得非常普遍，相對而言，不帶標簽的蛋白純化就非常困難，所以表達帶六個組氨酸標簽的蛋白配合IMAC純化變成最常用而且最有效的研究蛋白結構和功能的有力手段。
金屬螯合層析的分離原理
組氨酸（His）的殘基上帶有一個咪唑基團，可以和Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質上，因此帶有組氨酸標簽的蛋白在經過裝配了金屬離子的層析介質時可以選擇性的結合在介質上，而其他的雜質蛋白則不能結合或者僅能微弱結合。結合在介質上的HIS標簽蛋白可以通過提高緩沖液中的咪唑濃度進行競爭性洗脫，從而得到較高純度的HIS標簽蛋白。
同時半胱氨酸（Cys)的殘基上的巰基,色氨酸（Trp)的殘基上的吲哚基也可以Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結合在金屬螯合介質上。
經典金屬螯合介質
?Ni Seplife FF(IDA)——載量高，高流速，純化效率，但不適合含有8M尿素及EDTA,DTT的樣品純化。點擊下載：Ni螯合高流速瓊脂糖微球介質IDA說明書
?Ni Seplife 6FF(NTA)——載量高，耐受性，適合含有8M尿素及6M鹽酸胍的樣品的純化。點擊下載：Ni螯合高流速瓊脂糖微球NTA說明書
?Ni Seplife FF(TED)——耐受性好，可以耐受100mM EDTA，非常適合真核外泌蛋白的純化。可直接使用NaOH在位清洗，無需脫鎳掛鎳，省時省力。含有8M尿素及6M鹽酸胍的樣品用此鎳填料影響結合，低豐度的樣品結合效率效率差。點擊下載：Ni螯合高流速瓊脂糖微球介質TED說明書
?Ni Seplife HP（IDA)——小粒徑基質使其有更高的分辨率。
?IMAC Seplife FF(IDA)——可以自己鰲合不同的金屬離子，適合純化外露His，Cys，Try 殘基的蛋白。
His-Tag純化時金屬螯合介質的選擇
?科研微量制備——Ni Seplife HP（IDA)，此填料分辨率高，科研微量制備可用此填料純化，純度更高。
?樣品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,樣品中含有EDTA及DTT時無需換液直接過鎳柱純化。
?樣品中含有8M尿素（6M鹽酸胍）——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差，TED結合力弱，在含有高濃度尿素時結合效率差，所以含有變性劑的樣品首選IMAC的鎳柱。
?含有Cys/Try殘基蛋白——含有Cys/Try 殘基的蛋白和鎳填料的結合力弱，此時可以選擇IMAC Seplife FF(IAD)的填料螯合Cu離子進行親和純化（如烏司他丁可用此填料純化）
His-Tag融合蛋白純化常見問題
1.His標簽蛋白不和介質結合
a可能原因：超聲功率不合適（太大，蛋白碳化，太小，蛋白沒完全釋放）
解決方法：改變超聲功率或者其它方法破碎細胞。
b.樣品或緩沖液不合適
解決方法：確保緩沖液中螯合劑，還原劑，咪唑濃度不是很高。
c.His標簽暴露不完全
解決方法：在緩沖液中加變性劑（4-8M尿素，4-6M鹽酸胍），然后用IMAC介質純化。
d.His標簽丟失
解決方法：必要時增加His的個數并確保正確表達，同時降低上樣速度，確保足夠的孵育時間。
2.His標簽蛋白結合在介質上洗脫困難
a.可能原因：洗脫條件太溫和
解決方法：增加洗脫咪唑濃度或降低pH。
b.可能原因：蛋白沉積在介質上
解決方法：減少上樣量，優(yōu)化層析條件。
c.可能原因：非特異性結合
解決方法：緩沖液加2% Triton X-100和NaCl。
3.洗脫峰雜質多
可能原因：非特異性結合，清洗不徹底，降解等。
解決方法：純化過程加蛋白抑制劑防止降解，上樣完后要徹底清洗，加一定的NaCl和咪唑減少非特異性結合。
4.使用幾次后，介質結合效率降低，柱效降低。
可能原因：介質上沉積大量雜質等
解決方法：徹底清洗，IDA/IMAC脫鎳再生處理
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