概論

在結構研究和體外生物化學分析等很多實驗應用中都需要用到純化蛋白質。蛋白質可以從組織中獲取，亦或更經常的是從模式生物中過量表達獲得，如細菌、酵母或哺乳動物細胞培養等。蛋白質純化主要是根據它們各不相同的物理性質來從原料進行分離，其目的就是希望能浪費最少的雜蛋白，獲得最多的功能蛋白質。

親和層析

親和層析主要依靠蛋白質與介質配體間特異性的可逆結合作用進行分離。配體可直接與目標蛋白質結合，也可以與蛋白質共價結合的標簽結合。親和層析通常是一種最粗放的純化過程，一般在純化工藝的前期應用。基于后續應用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質。

親和層析的固定相是一種共價結合特異性配體的惰性介質，該配體可與一個蛋白質或一類蛋白質特異性結合。惰性介質通常是交聯的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質可采用選擇性或非選擇性模式來進行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對蛋白質有特異性作用的配體或共價結合的標簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結合能力。

圖 1. 用蛋白A、G、L進行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個功能區：一類蛋白質的Fc區（片段，恒定區） 都是相同的，Fv區（片段，可變區）是每個抗體各不相同的特異區，Fab（片段，抗原區）是抗體實際與特異性抗原結合的區域。B.抗體的特異性區域可以通過親和色譜進行非選擇性純化，在該過程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結合在分離介質上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。

兩類親和色譜中，在不影響蛋白質（或標簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對所有結合的蛋白質進行淋洗。最后用含有競爭分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質間相互作用的條件對結合蛋白進行洗脫。競爭分子可代替目標蛋白與配體相結合。這種競爭分子可通過其他層析手段或者透析的方式從目標蛋白中去除。通過破壞所有蛋白間相互作用來從固定相洗脫蛋白的方法包括調節緩沖液的pH值或者離子強度。因為這些方法同樣會影響蛋白質的穩定性，因此通常建議洗脫下來的蛋白質要立即中和或者稀釋以將危害降到最小。有報道稱，對于不同形式的親和層析，為獲得最高產率的活性蛋白需采用多種不同的流動相條件 [13, 14] 。

設計蛋白質表達質粒時，即可在其N端或C端（或在少數情況下，在結構已知蛋白質的柔性環狀區域） 引入親和標簽以助于純化。

抗體通常是基于抗體與其抗原 （抗體識別的序列） 間的高特異性相互作用來進行純化。一個含有抗原的多肽可以與帶有抗體特異結合位點的介質相結合。降低流動相緩沖液的pH值可破壞抗體/多肽間相互作用力，釋放出結合抗體。商業上，該方法常用于血清原液中抗體的純化。

rProtein A Seplife Suno

高載量，高耐堿性，完善的支持文件。

蛋白質同樣可通過非選擇性方式進行親和純化。在非選擇性純化過程中，固定相上結合的配體可以與一類具有類似結合部位的蛋白質相結合。DNA結合蛋白質的純化就是一個非選擇性親和層析的實例。因為肝素與DNA的結構和電荷極為類似，它可以被作為DNA結合蛋白質親和層析的配體。由于所有的DNA結合蛋白質理論上都可以與該固定相結合，幾乎其他所有蛋白質都會穿透而不與介質結合，從而可達到目標蛋白產率最大程度的富集。另一個例子是抗體通過其恒定區 （Fc）與配體間的相互作用進行富集濃縮，蛋白A、G、L都是常用的配體。

當采用類似的結合模式（抗體與蛋白A、 G或 L配體結合）時，抗體的抗原結合區（Fab）仍然保持與其特異性抗原結合的能力。因此，特異性蛋白可通過配體/抗體結合和抗體的抗原間的特異性相互作用來純化。

常見問題及解決方式見表2。

離子交換層析

離子交換層析分離蛋白的原理是基于其凈電荷的不同，通過蛋白質與帶電荷的固定相之間的靜電作用力進行分離。IEX有以下兩類: （1）陰離子交換層析 （固定相帶正電荷，與帶負電的蛋白質相結合）；（2）陽離子交換層析（固定相帶負電，與帶正電的蛋白質相結合）。離子交換層析常用于蛋白質純化工藝中期。但是，對某些蛋白，在純化工藝的前期或后期采用該方法亦可獲得良好的分離效果。

圖 2. 蛋白質凈電荷受其溶劑pH值影響。當pH=pI時，蛋白質凈電荷為0，因此既不與陰離子交換的固定相也不與陽離子交換的固定相相結合。調節pH值高于或低于pI值可使蛋白質帶上凈電荷，使其與陰離子交換樹脂（pH > pI）的固定相或者陽離子交換（pH < pI）的固定相相結合。

由于氨基酸的基本結構和與其共價結合的修飾成分的影響，所有的蛋白質都會帶有凈電荷。由于溶劑可以與蛋白質相互交換氫離子，因此蛋白質的凈電荷受其溶劑pH值的影響。蛋白質的等電點（pI）是蛋白質不帶電時的pH值。當pH值高于pI時，蛋白質會帶負電，而當pH值低于pI時，蛋白質帶正電。因此，可以通過調節溶液的pH值來控制結合蛋白是與離子交換柱結合或是從柱上洗脫。

SP Large Scale 

高剛性瓊脂糖微球離子交換介質

理論上來說，只要緩沖液pH值調節合適，所有的蛋白質都可以與陽離子交換柱和陰離子交換柱結合。但是，蛋白質純化過程中，選擇純化條件和層析柱類型時最重要的考慮因素就是要保持蛋白質的穩定性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會影響蛋白質穩定性和活性是必須要考量的。通常，一些與某類離子交換層析相結合的條件可能對某種蛋白質比對其他蛋白質更為合適。

了解蛋白質等電點的知識可幫助尋找最合適的離子交換層析方法。以下在線工具可計算一個蛋白質的理論等電點 EXPASY。這些計算都完全基于蛋白質的氨基酸序列，不考慮其三維空間結構。而在實際情況中，一個蛋白質的某些殘基可能暴露得比其他部分更多，所以，其實際pI和表面凈電荷某些時候可能與理論計算值不盡相符 [19] 。氨基酸的相對位置分布同樣會影響一個蛋白質的pI值 [20] ，而這一點在理論計算時同樣未予考慮。有些技術可通過實驗方法測得蛋白質實際的pI值，如等電聚焦電泳 [21] 、等電聚焦毛細管電泳 [22] 和高通量光學測量法等 [23] 。

蛋白質與IEX的結合必須采用較寬pH值范圍的溶液進行多次嘗試以獲得最合適的蛋白質保留pH值。在pI值左右1個pH單位的溶液pH值通常認為是較合適的蛋白質結合pH值 [24] 。但是，在有些情況下，也可能需要在遠離pI值的pH值條件下進行 [25] 。

圖 3. 離子交換層析。蛋白質在低離子強度條件下與帶電的固定相相結合。結合的蛋白質可以通過增加緩沖液的離子強度或者調節其pH值進行洗脫。

IEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質與帶電基團共價結合組成。介質微粒有很多尺寸，可以無孔，也可以有多種不同尺寸的孔。介質的選擇主要根據所需的結合能力、分辨率和流速要求來決定。介質顆粒尺寸越小，分辨率越高，但相應的流速也越低，分離時間也更長。多孔介質比無孔介質的結合能力更強。無孔介質中，蛋白質不能進入樹脂內部，因此相比多孔介質，前者的樣品回收率更高，分辨率更高，分離時間也更短。一個研究表明，對于大多數蛋白質，采用無孔介質和多孔介質的分辨率和回收率都類似，但對于尺寸較大的蛋白質，多孔介質由于體積排阻效應而在分辨率上有一定損失 [26] 。

IEX中最常用的4種帶電官能團如下所示。它們根據離子交換能力的強弱分類，強離子交換基團可離子化的pH范圍比弱離子交換基團的范圍更大。

陰離子交換 （固定相帶正電）:

1、季銨（Q） - 強陰離子交換基團

2、二乙氨乙基（DEAE） -弱陰離子交換基團

陽離子交換 （固定相帶負電）:

1、磺酸甲酯（S） -強陽離子交換基團

2、羧甲基（CM） - 弱陽離子交換基團

因為強離子交換基團的活性基團在很大的pH范圍內均可保持帶電，它可以在蛋白質結合所需pH值是特別強的酸性或堿性的情況下使用（假設該pH值下蛋白質穩定性仍得以保持）, [27] 。有些蛋白質在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強度洗脫 [28] 。由于高離子強度會影響部分蛋白質的穩定性 [29] ，而弱離子交換不需要在極端的pH值條件下進行蛋白質的結合，因此可能對蛋白質更合適。

離子交換色譜的固定相首先用低離子強度的緩沖液平衡，然后將蛋白質樣品用和平衡過程相同離子強度的緩沖液上樣到固定相。結合的蛋白質在用更高離子強度或pH值不同（圖6）的緩沖液洗脫前先淋洗一段時間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質。在離子交換層析中，某些鹽類代替結合蛋白和保持蛋白質穩定性的能力，可能比其他種類的鹽可能更有效 [30] 。NaCl或KCl是洗脫液中最常用的鹽類，其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子，Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面，還可以通過調節緩沖液的pH值來減少蛋白質的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對于結合到陽離子交換固定相上的蛋白質，增加緩沖液pH值會使蛋白質所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來。對于結合到陰離子交換固定相上的蛋白質，降低pH值可減少蛋白質所帶負電荷將其從柱上洗脫下來。

同時，還可以調節緩沖液的pH值使目標蛋白質不與離子交換固定相相結合，而與此同時雜蛋白與固定相結合。如此，可在穿透液中收集目標蛋白質，而雜蛋白通過與固定相結合得以去除。

與其他層析方法相比，離子交換層析在確定蛋白質結合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的最佳條件時可能需要解決更多的問題。

疏水層析

疏水作用層析（HIC）分離蛋白質主要是基于它們疏水性的不同。它常在蛋白質純化工藝的中期使用。在HIC中，蛋白質在高離子強度的緩沖液中與固定相結合，因此，無需更換緩沖液或者洗脫液即可在離子交換色譜之后直接應用HIC。同樣，HIC也可以跟在通過用鹽類沉淀快速去除部分而非全部蛋白質的硫酸銨沉淀步驟之后實施。HIC有時在純化工藝的前期使用，有時也作為最后一個步驟來去除目標蛋白中的微量雜質。

溶液中存在的鹽離子可能導致蛋白質的部分去折疊，暴露出部分常規情況下隱藏于內部的疏水殘基。當加入離子強度較低的緩沖液時，結合到固定相的蛋白質恢復到原折疊結構。由此，可減少其可與固定相相互作用的疏水殘基的暴露，有利于蛋白質從固定相上洗脫下來。因為蛋白質可以隨著離子強度的降低而自動地再折疊回原結構，所以HIC是一種非常有價值的一種蛋白質純化手段。

圖 4. 逐漸降低鹽（硫酸銨）濃度梯度從疏水柱上洗脫下的蛋白質。收集的組分需進行蛋白濃度和目標蛋白特異性活性的檢測。根據蛋白質活性檢測結果，目標蛋白的濃度在第45組組分中達到最高。

離子強度應該盡量低，使其可以促使目標蛋白結合，同時又不會導致蛋白質沉淀。如果結合所需離子強度高到導致目標蛋白的沉淀，可以使用略低的離子強度。這種情況下，層析過程可以將所有結合蛋白質與穿透的未結合目標蛋白分離開。

Phenyl Seplife FF(HS)

瓊脂糖微球疏水層析介質

在層析柱上樣前，固定相必須用高離子強度的緩沖鹽平衡（蛋白質樣品所使用的相同的緩沖液），然后柱上上樣，并淋洗一段時間后，再用較低離子強度的緩沖液將蛋白質洗脫（圖 7、8）。

圖 5. 疏水作用層析。在高離子強度下，蛋白質部分去溶劑化，使其通常隱藏在內部的疏水部分更多地暴露出來。這些殘基會與介質上的疏水官能團發生疏水相互作用。降低離子強度可以使蛋白質重新隱藏其疏水部分，折疊回復原結構。這會降低蛋白質與固定相之間的疏水相互作用，完成蛋白質的洗脫。

疏水作用層析的固定相是由交聯的瓊脂糖或合成的共聚高分子的骨架組成。骨架上共價連接上烷基或者芳香基的配體，以便與疏水性分子產生特異性相互作用。

官能團的種類包括：

1、烷基 - 不同長度的碳氫鏈結構，通常為丁基或者辛基。固定相的結合能力隨著烷基鏈的增長而增加 [31] 。官能團結合蛋白的能力主要是基于蛋白質的疏水性

2、芳香基 - 一種由芳環衍生而來的官能團，通常為芐基。芳香基的特異性通常更高，因為蛋白質還可以通過基本的堆積作用與該官能團相互作用。

每一種蛋白的結合和洗脫緩沖液所用鹽的種類和濃度都應經由實際實驗確定。此外，蛋白質的再折疊和活性在洗脫后都必須得到保證。

和其他柱層析類似，優化HIC工藝時也需要解決大量的問題。每一種蛋白都需要調節緩沖液條件和固定相以保證獲得最優化的分離。

凝膠過濾層析

凝膠過濾又稱為分子篩及體積排阻，體積排阻層析是根據蛋白質具有不同的水力學半徑將它們進行分離，該數據主要通過測量分子尺寸和形狀兩方面信息獲得。與上述其他層析過程不同的是，蛋白質不與SEC的固定相相結合，而是依靠它們通過惰性固定相的速度不同來完成分離。

圖 9. 三種不同水力學半徑的蛋白質混合物用體積排阻色譜柱分離。大蛋白因為不能進入介質孔道內部而只能直接流經柱體最先流出。稍小的蛋白質會進入介質孔道內部，流經的路徑更復雜，因此需要更多的時間來穿過介質并流出柱體

基于SEC可分辨不同種類蛋白的能力，它通常是一種用于最后一步純化的有效方法。低聚物 [32] 、去折疊的蛋白分子 [33] 和缺失蛋白 [34] 都可以在逐漸置換緩沖液的過程中與結構完整的天然蛋白質分子分離開。通常，由于SEC可使用溶劑種類更多，所用的緩沖鹽也更少，因此比透析的緩沖液置換過程更快也更可靠。整個SEC過程都只使用一種溶劑，而市購的SEC固定相幾乎與所有常規的緩沖液兼容。

固定相的類型和柱子的長度對蛋白質的SEC分離的分辨率有很大的影響。市場上有很多種固定相可選，其選擇最好是根據待分離蛋白質分子的分子量和分離條件兩方面來決定。

Seplife 6FF

超螺旋質粒，病毒等凝膠過濾層析分離介質

與其他層析方法一樣，SEC同樣既有優點也有缺點。是否采用SEC要取決于蛋白質本身及其后續應用的要求。

SEC的優點：

1、可進行緩沖液交換和脫鹽。

2、可分離其他純化技術難以分離的相似品種（如蛋白片段和低聚物）。

3、可與多種溶劑相容。

4、不依賴于蛋白質的任何一種特殊形式進行保留和洗脫。

SEC的缺點:

1、分離效果嚴重依賴柱子的填裝效果。

2、蛋白質與介質間有非特異性相互作用，會降低分辨率。

3、對復雜的蛋白質混合物分辨率低。

4、為保證足夠的分辨率，上樣量必須較小。這對沉淀得到的高濃度蛋白質是一個問題。

要優化SEC條件以獲得最好的分離效果，常常需要耗費大量時間，而一些因素會對分離效果產生非常大的影響。

提高SEC分離效果的條件:

1、上樣體積盡量最小。上樣體積越小，洗脫組分的擴散將會越弱。

2、緩沖液中加鹽。少量的鹽有助于防止蛋白質與固定相間的非特異性相互作用。這將保證所有的蛋白質可以穩定地流過整個層析柱。

3、采用合適的流速。流速過快使得小分子沒有足夠的時間流經介質孔道，流速過慢則會導致樣品擴散時間增加。

4、保證樣品和溶劑的黏度接近。調整樣品的條件使其與洗脫緩沖液的類似。

5、調整層析柱長度。柱子過短使蛋白質分離不充分。而柱子過長則使得蛋白質樣品擴散嚴重。

6、重裝柱子。柱子的填裝效果會蛋白質的分離效果有相當大的影響。

如果介質顆粒沒有分布均勻或者填裝時帶入氣泡，蛋白質將不能順利地流過固定相。此外，如果柱子跑干了，就必須重裝。柱子填裝不好通常就是分離效果不好的原因。

由于SEC并不是基于蛋白質官能團間的相互作用來進行分離，所有的蛋白質都在相同的條件下進行洗脫，所以分離效果僅僅依賴于蛋白質各自不同的水力學半徑。因此，SEC通常不適合在含有較多雜蛋白的純化工藝前期使用。但是，SEC又可作為一種快速可靠的樣品脫鹽或者小分子去除方法用于分離工藝前或中期。在純化的最后階段，當只剩痕量雜蛋白時，SEC則是一種蛋白質分離和置換保存緩沖液的有效方法。

蛋白質洗脫方法

固定相上結合的蛋白質要用可破壞結合作用力的溶劑條件進行洗脫。這些流動相的條件要根據層析類型和目標蛋白質的性質來選擇。蛋白質洗脫方法通常包括以下三種：批次洗脫，階梯式洗脫和線性梯度洗脫。如何選擇最好的方法要依靠采用的層析方式和所需的分離效果來決定。

1、批次洗脫 - 一步即將所有結合蛋白質一次性洗脫。基于特異性相互作用 （如親層析）的層析方法最好采用這種方式。批次洗脫法沒有任何分離效果，但它可以很好地快速去除雜質。它需要事先了解取代目標蛋白所需的緩沖液條件。

2、階梯式洗脫 - 連續進行多步批次洗脫，并每次逐漸增強洗脫條件。在階梯式洗脫中，收集的組分數取決于連續批次洗脫的次數。階梯式洗脫比批次洗脫的分離效果要好，但比線性梯度洗脫的效果要差。

3、線性梯度洗脫 - 當流動相以線性梯度洗脫時可收集多種連續流出的組分。對于離子交換層析和疏水作用層析，線性梯度洗脫可以獲得最好的分離效果，同時，它還可以收集到大量的連續組分。

由于體積排阻層析中蛋白質和固定相之間不存在相互作用，因此不需要采用任何一種上述洗脫方法。蛋白質上樣后，無需改變洗脫緩沖液的條件，即可連續不斷地收集各分離組分至所有蛋白質全部被洗脫為止

理想的情況是這根層析柱所采用的洗脫緩沖液同樣可用于后續的層析柱，由此可省去兩步之間必須的緩沖液置換或者透析操作。

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