重組亞單位新冠疫苗
新冠病毒（SARS-CoV-2 ）包含S蛋白 (spike protein)，N蛋白(nucleocapsid protein)，E 蛋白(envelope protein)和M 蛋白(membrane protein)四種結構蛋白(如圖1)1。其中S蛋白負責病毒識別宿主細胞受體并介導病毒與宿主細胞膜的融合，是病毒打開宿主細胞“大門”的“鑰匙”，也是病毒感染后引起宿主免疫系統產生中和性抗體的主要靶標，因此S蛋白在新冠疫苗開發中備受關注。新冠基因工程重組亞單位疫苗，是通過基因工程的方法，在體外制備新冠S蛋白（刺突糖蛋白）或者S蛋白片段制備而成的疫苗，所以新冠基因工程重組蛋白疫苗也有多種技術路線。
中國生物研究院基于自主建立的計算結構疫苗學技術平臺，在第 一 代重組新冠疫苗（NVSI-06-07）的基礎上，通過對流行株突變位點的進化規律和免疫逃逸能力進行計算分析，設計研發的第二代廣譜新冠疫苗（突變集成三聚化RBD）。
亞單位新冠疫苗制備工藝
1.基因序列設計：在體外制備新冠S蛋白（刺突糖蛋白）或者S蛋白片段制備而成的疫苗，目前選取RBD片段做抗原基因被廣泛使用于疫苗的開發，序列設計時將RBD串聯起來以重組表達同型二聚體及三聚體，在基因序列設計時加入His-tag序列或者Fc片段，通常加在C端，蛋白表達后切除His-tag或Fc對蛋白的性質沒有影響，若加在N端，切除后對蛋白的性質可能會造成一定的影響，同時加入His-tag或Fc序列也要考慮酶切位點序列。
2.克隆：將構建好的基因轉讓至CHO或者Bac-to-Bac表達系統中。
3.細胞培養：略
4.固液分離：離心去除細胞等固形物。
5.澄清：CHO或Bac-to-Bac表達系統表達的RBD及RBD二聚體及三聚體均分泌在細胞培養液中，離心后的上清液用深層過濾等微濾膜組件澄清處理。
6.純化：
6.1.RBD單體純化：澄清后的抗原原液根據克隆時帶的標簽，用Ni Seplife FF(TED)-His標簽，rProtein A Seplife Suno-Fc標簽進行快速捕獲，去除大量的HCP等雜質，減少體積；親和層析后再經凝膠過濾層析Seplife S-100中度純化去除聚集體及片段，后再經離子交換層析Q Large Scale 去除痕量的HCP及內毒素。此過程中要注意緩沖液及鹽濃度對過程的影響，必要的情況下要進行超濾伴隨洗濾的方式或者用凝膠過濾層析Seplife G-25 M進行緩沖液置換，同時要注意緩沖液對RBD收率及穩定性的影響，可以嘗試添加一些添加劑如甘油，精氨酸等來提高RBD的穩定性，減少沉淀及聚集體的產生。
6.2.RBD二聚體純化：捕獲階段同RBD單體捕獲，根據所帶標簽選擇對應的親和層析；捕獲的RBD二聚體去除多聚體及片段時選用Seplife S-200凝膠過濾填料純化，此工序也可嘗試用多模式層析MA Large Sacle 采用pH伴隨鹽雙梯度洗脫模式進行分離，分離后根據結果再用離子交換層析去除痕量的HCP及內毒素。
6.3RBD三聚體純化：同RBD二聚體純化。
7.調整抗原蛋白濃度及置換緩沖液:用超濾伴隨洗濾的方式調整抗原蛋白濃度及置換緩沖液。
8.除菌過濾：用0.22um的濾芯除菌過濾。
9.制劑化（略）。
第二代重組亞單位新冠疫苗：在原型株+Delta + Omicron 等變異株，及對流行株突變位點的進化規律和免疫逃逸能力的基礎上，進行RBD序列優化設計開發，同樣有RBD單體，RBD二聚體，RBD三聚體等多種設計路線，下游工藝同原型株株RBD亞單位疫苗下游工藝整體思路。
參考資料
2、An Y., Li S., Jin X, et al.A tandem-repeat dimeric RBD protein-based COVID-19 vaccine ZF2001 protects miceand nonhuman primates. bioRxiv 2021.03.11.434928;
3、專利號：CN201511021538.8（一種基于二聚化的受體結合區亞單位冠狀病毒疫苗）
4、Tectonic conformational changesof a coronavirus spike glycoprotein promote membrane fusion
5、Structure-based design ofprefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes
6、Ma X, Zou F, YuF, et al. NanoparticleVaccines Based on the Receptor Binding Domain(RBD) and Heptad Repeat (HR) ofSARS-CoV-2 Elicit Robust Protective Immune Responses. Immunity. 2020 Dec15;53(6)
