建立蛋白質層析純化工藝時，最重要的是需要考慮純化得到的蛋白質應能滿足其后續應用要求。蛋白質的數量及純度都必須滿足實驗分析要求。而且，因為后續研究需要的是保持良好折疊結構的活性蛋白質，因此蛋白質行為的相關信息也需要考慮。在純化及后續的保存過程中，很多處理方法都會對蛋白質的性質產生影響，如蛋白質的去折疊、聚集、降解和失活等。制定詳細計劃，在最短時間內完成蛋白質純化，并在最穩定的條件下進行保存才算是成功地完成了其整個純化過程。
當我們純化蛋白時，最重要的就是要保持蛋白在純化過程中不能去折疊、聚集、降解和失活，或者是盡量降低純化過程對蛋白活性帶來的損失。這就要求蛋白在整個純化過程中要始終保持可溶性和活性。
在層析工藝緩沖液選擇時應考慮以下幾個因素：pH值、緩沖體系、添加劑。其中每一個因素都要根據你的目的蛋白進行優化，并以目的蛋白的活性作為優化的評估標準。
pH的選擇
在蛋白質層析工藝中，首先我們要考慮蛋白質的pH穩定性和可溶性，一般蛋白質在其pI附近的pH值溶液中容易沉淀。在層析工藝開發前，我們先要驗證目標蛋白的pH穩定性。每一種層析介質都有它的工作pH范圍，我們在開發層析工藝時，要了解所選擇的層析介質的工作pH范圍。所以我們設計層析工藝時，同時要考慮蛋白質的pH穩定性范圍及層析介質的工作pH范圍。
緩沖液體系的選擇
每一步純化過程中，蛋白質的溶液環境對其穩定性和活性的保持都非常關鍵。蛋白質應該保存在一個良好的緩沖液環境中，要避免突然的pH值變化，以其防止對蛋白質折疊狀態、溶解性和活性造成不可逆的影響。
圖 1. 含Tris堿及其酸式物的Tris緩沖液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示當pH=8.06，50%的Tris是質子化（酸式結構），50%是去質子化（堿式結構）。
緩沖液是一種含有共軛酸/堿對的水溶液。緩沖液的pH值范圍根據其pKa值決定。該pKa值定義為50%的分子為酸式結構，50%為堿式結構時的pH值 （圖1）。關于緩沖液的一個常規原則是，其pH值應保證在pKa值左右1個pH值單位范圍內，從而保證其具有良好的緩沖能力。如此可以保證同時有足夠的以酸式結構和堿式結構存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 時可以將它們中和。這樣，緩沖液就可以防止pH變化導致的蛋白質穩定性改變。
一種好的緩沖液必須具有以下特征 :
?水溶性
?化學穩定性
?在所需pH范圍內良好的緩沖能力
?與分析和實驗應用條件具有良好的兼容性
?與其他溶質具有良好的兼容性
很多物質都可以用于生物緩沖液。最常使用的緩沖液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范圍左右使用。表1列出了4種最常用的生物緩沖液、各自的pH值應用范圍及各自可能對蛋白質純化過程產生影響的優缺點。為保證足夠的緩沖能力，這些緩沖液的濃度通常為25mM。
表一：蛋白質純化中最常用的生物緩沖液。緩沖液在一定pH值范圍內可保持它們的緩沖能力，部分緩沖液成分會對某些層析過程或者分析實驗造成影響。
添加劑的選擇
除了一個合適的緩沖液體系，蛋白質純化過程中——從溶菌到保存——所使用的溶液通常還含有很多其他對蛋白質純度、穩定性和活性方面均具有一定作用的成分。溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會添加蛋白酶抑制劑以防止目標蛋白質被內源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因為此時幾乎所有的蛋白酶都已經從目標蛋白質分離出去。蛋白質的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結合以防止目標蛋白質被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護蛋白質不被破壞和增強其溶解性。
表二：蛋白質純化中用于增強蛋白質穩定性的常用添加劑。
添加劑只在必要時才使用。可能需要多次嘗試才能確定某些添加劑是否對一些特定蛋白質的純化工藝有效。
