Seplife? LXPM Ni 5504 NTA層析介質(zhì)是以聚丙烯酸酯為基質(zhì)，在表面進行了親水性改性再偶聯(lián)螯合基團制成，具有親水性好、高載量、分辨率高、非特性吸附小，物理化學(xué)穩(wěn)定等特點。Seplife? LXPM Ni 5504 NTA廣泛應(yīng)用于分離純化能被金屬離子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及帶His 標簽的重組蛋白。

使用方法

3.1 裝柱

勻漿濃度等于靜置膠體積除以除以勻漿后的總體積。采用0.5M NaCl勻漿可獲得最佳裝柱效果，其濃度為60%-70%。方法如下：

1)色譜柱的柱體積 V，V=Ac×L，Ac=π×r2。

Ac：色譜柱橫截面積；L:色譜柱高度；r：色譜柱半徑。

2) 攪動介質(zhì)形成勻漿液，量取所需質(zhì)量或體積。其為柱體積的1.2倍左右，防止收縮。

3）用 0.5 M NaCl 溶液置換20%乙醇，平衡過夜。

4）裝柱之前，用 0.5 M NaCl 溶液調(diào)整勻漿濃度為 65 ~ 70%；將勻漿一次性倒入層析柱，沉降平衡后標注高度。

5）將分配器裝入，調(diào)節(jié)高度使得壓縮系數(shù)為 1.05 ~ 1.10；然后啟動輸液泵，用 1.5~2 倍工作流速使柱床穩(wěn)定。

6）按照 SOP 進行柱效和對稱性的測定，須達到預(yù)定標準。

3.2 柱效評價 

裝好之后，色譜柱用3-5體積超純水清洗。100cm/h流速平衡并進行柱效測試。

離子交換層析柱的柱效測試方法

樣品：      2 M NaCl 溶液

上樣量：    1~5 % 柱體積

洗脫液：    0.5 M NaCl 溶液

線性流速：  100 cm/h

檢測：      UV @ 280 nm，2 M NaCl 上樣：電導(dǎo)檢測儀

3.3 清洗

裝好的色譜柱應(yīng)使用至少使用5BV的去離子水清洗。

3.4 平衡

使用適當?shù)?-10倍柱體積緩沖液進行柱子的平衡，至流出液電導(dǎo)和PH不變（與平衡液一致），具體的緩沖體系應(yīng)根據(jù)目標蛋白特性及穩(wěn)定性進行篩選和優(yōu)化。

3.5上樣 

固體樣品可用平衡液溶解配制；低濃度樣品溶液可用平衡液透析；高濃度樣品溶液可用平衡液稀釋。為了避免堵塞層析柱，樣品應(yīng)經(jīng)離心或膜過濾處理。進料量根據(jù)介質(zhì)的載量和料液中目標蛋白的含量計算，上樣前確保樣品緩沖液應(yīng)盡可能與平衡液一致。此外，還需注意以下事項：

（1）樣品一般溶解于pH6～8的初始緩沖液中，提高上樣緩沖液的pH值可以增大載量。

（2）緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，同時最好避免巰基乙醇、DTT等還原劑。

（3）常用緩沖液有10～100mmol/L磷酸鈉緩沖液、20～200mmol/L Tris-HCl緩沖液等。

（4）緩沖液中一般要加入0.15～0.5mol/L的NaCl以消除離子交換作用。

3.6洗脫 

上樣完畢后繼續(xù)用平衡緩沖液淋洗至基線穩(wěn)定，可以根據(jù)實際情況采取以下幾種方法洗脫吸附于層析介質(zhì)上的樣品：

（1）降低pH洗脫：大多數(shù)蛋白在pH 4~6會被洗脫下來（也可以在pH 3~4），緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸和磷酸鹽緩沖體系。

（2）競爭性洗脫：線性增加或一步增加同金屬離子有親和力的競爭物質(zhì)的濃度（如0~0.5mol/L咪唑、0~50 mmol/L組氨酸、0~2mol/L NH4Cl）。

（3）螯合劑洗脫：EDTA、EGTA 等螯合劑可同金屬離子產(chǎn)生作用力會使蛋白被洗脫下來。但是此法不能分離不同的蛋白，會影響蛋白的吸附，導(dǎo)致融合蛋白無法掛柱。

備注：（1）初次使用時，如不確定洗脫需要的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中分別加入10mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L咪唑，濃度從低到高分別洗脫和收集重組蛋白，之后通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫結(jié)果。

（2）咪唑為堿性，相應(yīng)緩沖液配制后需要用HCl調(diào)節(jié)pH值。

（3）降低pH洗脫和螯合劑洗脫會使金屬離子脫落，下次使用前需重新螯和金屬離子。

（4）有條件的可以進行咪唑梯度線性洗脫以確定較佳的洗脫條件。

上述洗脫方法，均須在緩沖液中加入150~500mmol/L的NaCl以消除離子交換作用。

3.7再生 

（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子時，必須將凝膠脫鎳再生。脫鎳方法：首先用5~10個柱床體積的蒸餾水淋洗柱子，然后用5~10個柱床體積的100mmol/L EDTA淋洗柱子，最后用2~3個柱床體積的0.5mol/L NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法：用0.1~1.0 mol/L NaOH反向清洗柱子，50 cm/h保持1~2 h，不僅可以去除結(jié)合強的雜質(zhì)，也可以去除熱源。

（3）清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：首先用2~5個柱床體積的蒸餾水充分平衡脫鎳后的柱子，然后用0.1~0.3mol/L金屬鹽溶液過柱5~10個柱床體積以螯合金屬離子，最后用5~10個柱床體積的蒸餾水淋洗以去除未螯合的金屬離子。

3.8 在位清洗 

為了保持層析柱的性能，若有蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)在再生過程中未能有效去除，可執(zhí)行在位清洗步驟，具體操作步驟如下：

（1）去除因離子交換作用吸附的蛋白：用2mol/L NaCl溶液反向清洗2~3個柱床體積。

（2）去除強疏水性蛋白和脂質(zhì)等：用70%乙醇或者30%異丙醇反向清洗4個柱床體積。

（3）除去沉淀蛋白、疏水性蛋白：參照凝膠再生步驟。

3.9 應(yīng)用案列

（1）樣品：protein A重組蛋白樣品，C=2mg/ml。

（2）填料：1ml預(yù)裝柱，7*25mm

（3）上樣量20ml；

（4）流動相A1：1*PBS+15mM咪唑，PH7.3

流動相B：1*PBS+1mol/L 咪唑，PH7.3

圖1.Seplife? LXPM Ni 5504 NTA純化蛋白色譜圖

備注：紅色曲線：Seplife? LXPM Ni 5504 NTA

綠色曲線：某外樣

4.存儲

暫時不使用的層析介質(zhì)需保存在 4~30 ℃ 的 20%乙醇中，已經(jīng)裝好的層析柱應(yīng)保存在含 20%乙醇的緩沖液(pH 7.0)；使用前請裝柱后將乙醇清洗干凈。

5.運輸

運輸中避免日曬、雨淋、重壓，嚴禁與有毒、有害物品混運。

生產(chǎn)日期：見標簽

使用期限：在適當?shù)馁A藏條件下可貯藏5年

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